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森工健维

花旗松素对人肺癌细胞 A549 增殖的抑制作用及其机制研究

李 雪 1，赵明智 2*，郭瑞霞 1

1. 邯郸市第一医院 呼吸二科，河北 邯郸 056002 2. 河北大学附属医院 肿瘤科，河北 保定 071000

摘 要：

目的 研究花旗松素对人肺癌细胞 A549 增殖的抑制作用，并探讨其诱导细胞凋亡的可能机制。

方法 WST-1法检 测不同质量浓度（0～200 μg/mL）花旗松素对 A549 细胞增殖的影响；Annexin-V/PI 双染法检测花旗松素对 A549 细胞凋亡 的影响；细胞免疫荧光法观察花旗松素处理后 A549 细胞中凋亡蛋白 Bax 的表达；Western blotting 法检测 Bcl-2、Akt、P53 蛋白表达的变化。结果 WST-1法检测到花旗松素能有效抑制 A549 细胞的增殖，呈现时间–剂量–效应关系。通过流式细 胞仪分析，花旗松素诱导细胞凋亡，上调了促凋亡蛋白 Bax 的表达，下调抗凋亡蛋白 Bcl-2 的表达，抑制 Akt 的过表达，并 且促进 P53 的表达。结论 花旗松素对 A549 细胞的增殖具有显著的抑制作用，其诱导的凋亡机制可能与 Bcl-2、Akt 相关信 号通路的激活有关。 关键词：花旗松素；人肺癌细胞 A549；抑制作用；机制

中图分类号：R966；R979.1

文献标志码：A 文章编号：1674 - 5515(2015)03 - 0249 - 04 DOI:10.7501/j.issn.1674-5515.2015.03.004

Inhibition of taxifolin on proliferation of human lung cancer cell A549 and its mechanism

LI Xue1, ZHAO Ming-zhi2, GUO Rui-xia1 1. Second Department of Respiratory Medicine, Handan First Hospital, Handan 056002, China 2. Department of Oncology, Affiliated Hospital of Hebei University, Baoding 071000, China

Abstract: Objective To investigate the inhibition of taxifolin on proliferation of human lung cancer cell A549, and study the possible mechanism of inducing cell apoptosis. Methods WST-1 assay was employed to evaluate the inhibition of taxifolin with various concentrations from 0 μg/mL to 200 μg/mL on proliferation of A549 cells. With Annexin V and PI dual parameter markers, A549 cell apoptosis was detected by flow cytometry of taxifolin. The expressions of Bax, Bcl-2, Akt, and P53 were evaluated by Western blotting or immunocytochemistry. Results The WST-1 results showed that taxifolin could inhibit A549 cell viability with time-drug concentration-proliferation inhibition rate relationships. The results of Western blotting and fluorescence microscope showed that taxifolin could induce apoptosis of A549, up-regulate express of pro apoptotic protein Bax, down-regulate express of anti apoptotic protein Bcl-2, inhibit expression of Akt, and also induced the expression of P53. Conclusion Taxifolin can significantly inhibit the proliferation of A549 cell, and its mechanism may be related to activate the pathway of Bcl-2 and Akt-dependent apoptosis in A549 cells. Key words: taxifolin; human lung cancer cell A549; inhibitory action; mechanism

花旗松素是一种具有多种生物活性的二氢黄酮 类化合物，广泛地存在于各种植物、水果和食物中。 已有一些报道证实花旗松素对多种癌细胞如肝癌细 胞、乳腺癌细胞、宫颈癌细胞等均有抑制作用[1-3]。 目前世界范围内肺癌所引起的死亡占所有肿瘤引起

的死亡的首位。本研究以人肺癌细胞 A549 为研究 对象，通过观察花旗松素对 A549 的抑制效应，进 一步研究花旗松素抑制肺癌细胞增殖的作用机制， 为深入研究花旗松素抗肿瘤机制提供实验基础，应 用于临床治疗肺癌提供理论依据。

试药与仪器

人肺癌细胞 A549 由天津医科大学惠赠，细胞 来自 ATCC 细胞库。花旗松素（质量分数＞97%， 美国 Sigma 公司），二甲基亚砜（DMSO）、WST-1 试剂盒（产品货号 C0038，碧云天生物技术研究所）； AnnexinV-FITC/PI 凋亡检测试剂盒（货号 KGA107， 南京凯基生物科技发展有限公司） ；Bcl-2（货号 SC-7382）、Bax（货号 SC-1616）、Akt（货号 sc- 65487）、P53（货号 sc-126）、 β-actin（货号 sc-47778） 鼠单抗（美国 Santa Cruz 公司）；PVDF 膜（美国 Roche 公司） ；ECL 试剂盒（NCI 5080，美国 Amersham Bioscience 公司）；胎牛血清、RPMI-1640 细胞培养液（美国 Hyclone 公司）。

BX-61 荧光显微镜（日本 Olympus 公司）； FACSCalibur流式细胞仪（美国BD公司）；BIO-RAD iMark 酶标仪（美国 BIO-RAD 公司）。

实验方法

2.1 细胞培养 采用10%血清的高糖DMEM培养基， 将A549 于 37 ℃、5% CO2 的培养箱中培养。细胞对数生 长，且呈单层贴壁，根据实验需求，调整不同细 胞浓度。接种细胞 12 h 后开始进行不同浓度药物 处理。

2.2 WST-1 法检测花旗松素对 A549 增殖的影 响[4-5] 调整细胞密度为 6.0×104/mL，接种于 96 孔板， 每孔 100 μL，设对照和 5 个复孔，接种 12 h，细胞 融合良好。实验组加不同质量浓度花旗松素溶液， 使终质量浓度分别为 25、50、100、150、200 μg/mL。 对照组加入等体积的培养基。

细胞给药后，在培养 箱分别继续培养 3、6、12 h。结束培养前 1 h，每孔 加 WST-1 溶液 10 μL，继续培养 1 h。在酶标仪检测 570 nm 波长处的吸光度（A）值，根据细胞活力＝ A 给药/A 对照计算细胞活力。

2.3 Annexin-V/PI双染法检测花旗松素对A549细 胞凋亡的影响 采用流式细胞技术检测花旗松素对 A549 凋亡 的影响。细胞以 l×106接种于 6 孔板中，12 h 后加 入终质量浓度分别为 50、100、200 μg/mL 花旗松素 溶液，并设对照组，分别于 37 ℃、5% CO2饱和湿 度条件下培养 12 h 后胰酶消化收获细胞。离心收集 悬浮细胞，微量离心机 2 000 r/min 离心 5 min，弃 培养基。

用冷 PBS 洗涤离心细胞两次。用 400 μL Binding Buffer 悬浮细胞，在细胞悬浮液中加入 5 μL Annexin V-FITC，轻轻混匀后于 4 ℃避光条件下孵 育 3 min。加入 10 μL PI 后混匀，于室温避光孵育 1 min。立即进行流式细胞仪检测。结果用 BD FACSCalibur 流式细胞仪进行数据分析。

2.4 细胞免疫荧光观察花旗松素对凋亡蛋白 Bax 表达的影响 l×105 细胞采用细胞爬片的方法接种于 24 孔 板中，12 h 后加入终质量浓度分别为 50、100、 200 μg/mL 花旗松素溶液，并设对照组，分别于 37 ℃、5% CO2 饱和湿度条件下培养 12 h。吸出 上清液， −20 ℃甲醇固定 20 min 后，PBS 洗 3 次， 1% Triton 通透 15 min，PBS 洗 2 次，5% BSA 封 闭 20 min，孵育 Bax 一抗，4 ℃过夜，次日 PBS 洗净，荧光二抗室温 1 h，PBS 洗净，在荧光显微 镜下观察。

2.5 Western blotting 检测花旗松素对蛋白表达的 影响 收集各组细胞，PBS 洗 3 次，用蛋白裂解液冰 上裂解 30 min 后，4 ℃、12 000×g 离心 20 min， 取上清用Bradford法测定蛋白，配平各组蛋白浓度， 100 ℃蛋白变性。上样量为每孔 30 μg 蛋白， SDS-PAGE 电泳后转膜至 PVDF 膜上，5% BSA 封 闭 2 h，鼠抗 4 ℃冰箱过夜（1∶100），TBST 清洗 5 min×3 次，二抗（1∶2 000）室温孵育 2 h，TBST 洗涤 5 min×4 次，ECL 系统显影。

2.6 统计学分析 采用 SPSS 16.0 软件进行统计学处理，数据以 x ± s表示，组间比较用单因素方差分析。

实验结果

3.1 花旗松素对 A549 增殖的影响 花旗松素质量浓度在 50 μg/mL 以下时对 A549 细胞增殖无明显抑制作用。不同孵育时间时，花旗 松素的IC50也不同， 3、 6、12 h的IC50分别是128.24、 95.16、82.76 μg/mL，提示花旗松素的抑制作用呈现 时间–效应关系。孵育时间为 12 h 时，25 μg/mL 花旗松素溶液的细胞活力为 87.84%，而 200 μg/mL 花旗松素溶液的细胞活力仅为 23.86%，提示花旗松 素的抑制作用呈现浓度–效应关系。

由于 200、150 μg/mL 花旗松素溶液作用 12 h 对 A549 的活力影响差异没有显著性，因此接下来的实 验采用 50、100、150 μg/mL 终质量浓度的花旗松素 溶液作用 12 h。

3.2 花旗松素对 A549 细胞凋亡的影响 流式细胞 Annexin V/PI 检测细胞凋亡表明，花 旗松素作用 12 h，随着质量浓度的增高，早期凋亡 和晚期凋亡细胞的比例都逐渐增加，对照组的凋亡 率为 1.33%，说明细胞状态良好，50 μg/mL 花旗松

表 1 不同质量浓度花旗松素对人肺癌细胞 A549 细胞活力 的影响（x ± s，n=5） Table 1 Effects of taxifolin with various concentrations on cell viability of A549 cells (x ± s, n=5 )

素溶液给药组的凋亡率为 15.78%，100 μg/mL 花旗 松素溶液给药组的凋亡率为 30.74%，与对照组比较 差异均具有显著性（P＜0.05）。结果见表 2、图 1。

3.3 花旗松素对凋亡蛋白 Bax 表达的影响 细胞免疫荧光结果显示，对照组凋亡蛋白 Bax 表达微弱，随着花旗松素质量浓度的增加，细胞的 数量减少，但荧光强度逐渐增加，提示花旗松素上 调了促凋亡蛋白 Bax 的表达。结果见图 2。

表 2 不同质量浓度花旗松素处理 A549 细胞后对凋亡率的 影响（x ± s，n=5） Table 2 Effects of taxifolin with various concentrations on apoptosis in A549 cell (x ± s, n=5 )

图 1 花旗松素对 A549 细胞凋亡率的影响 Fig. 1 Effects of taxifolin on apoptosis rates of A549 cells

图 2 花旗松素上调 A549 细胞中 Bax 蛋白表达 Fig. 2 Effects of taxifolin on Bax expression of A459 cells

3.4 花旗松素对蛋白表达的影响 Western blotting 检测结果表明，花旗松素作 用于细胞后，50 μg/mL 花旗松素溶液对抗凋亡蛋 白 Bcl-2 的影响不显著，但是 100 μg/mL 花旗松素 溶液显著下调了 Bcl-2 的表达；同时对 Akt 通路 也有显著的影响，并且激活了 P53 通路。随着花 旗松素质量浓度的增加，调控作用也越来越明显。 结果见图 3。

4 讨论 WST-1 实验结果表明，固定给药时间，细胞活 力随着花旗松素质量浓度的增加而降低，孵育 12 h 时，25 μg/mL 花旗松素溶液的细胞活力为 87.84%， 而 200 μg/mL 花旗松素溶液的细胞活力降至 23.86%。100 μg/mL 花旗松素溶液作用 3、6、12 h 时，细胞活力逐渐降低，分别为 54.86%、45.11%、 35.47%。提示花旗松素对 A549 细胞的增殖的抑制 作用呈现时间–剂量–效应关系。细胞凋亡实验也 进一步验证了花旗松素对细胞活力的抑制作用。 Bcl-2 蛋白家族参与了内源性凋亡信号通路，因 此实验检测了 Bcl-2 蛋白家族中与凋亡相关的蛋白 的表达，即 Bcl-2 和 Bax 的表达。Western blotting 结果显示，随着花旗松素质量浓度的增加，会下调 Bcl-2 蛋白的表达，促进细胞凋亡。免疫荧光结果表 明，随着花旗松素质量浓度的增加，绿色荧光强度 明显增强，提示促进了 Bax 蛋白的表达，这一结果 与 Western blotting 的结果一致，皆证实了花旗松素 激活了凋亡信号通路。 细胞凋亡过程是一个复杂的过程，还有多种蛋

白和信号通路也参与其中，包括 Akt 信号通路。Akt 表达水平的升高，可以起到保护细胞，并且抑制细 胞凋亡的作用。Akt 的下游信号传导通路包括 Akt 的活化，激活 NF-κB 蛋白，刺激 COX2 的表达[6-7]， 抑制细胞凋亡。Akt 的活化也会抑制 p53 蛋白的激 活，从而抑制细胞凋亡。Akt 和 Bcl-2 蛋白家族也有 关联，通过促进 Bax 蛋白磷酸化而失活，实现抑制 凋亡。Western blotting 实验结果显示，花旗松素可 以抑制 Akt 的过表达，并且促进 P53 的表达，随着 剂量的增加，调节作用增强，进一步证实了花旗松 素抑制 A549 增殖的分子机制。 综上所述，花旗松素具有明显的诱导 A549 细 胞凋亡的作用，所涉及的信号通路是一个复杂过程， 本研究初步探讨了其分子机制，对其详细的分子机 制有待完善。花旗松素具有毒副作用小、来源广泛 等优点，深入探讨其作用的分子机制具有十分重要 的科学意义和应用前景。

参考文献

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